Mała zmiana w RNA, duży wpływ na odporność wrodzoną

Naukowcy z Międzynarodowego Instytutu Biologii Molekularnej i Komórkowej w Warszawie (IIMCB), pracujący pod kierunkiem prof. dr. hab. Gracjana Michlewskiego, wykazali, że niewielka różnica na początku cząsteczki RNA może wpływać na to, jak silnie komórka uruchamia mechanizmy odporności wrodzonej, odpowiedzialne za obronę przed wirusami.

Badanie, opublikowane w Molecular Cell, wskazuje, że RNA rozpoczynające się od adenozyny (A) może wywoływać silniejszą odpowiedź immunologiczną niż bardzo podobne RNA rozpoczynające się od guanozyny (G). To odkrycie dodaje ważny element do rozumienia, dlaczego niektóre cząsteczki RNA są dla komórek bardziej „alarmujące” niż inne.

Jak komórka rozpoznaje niebezpieczne RNA?

Badanie dotyczy białka RIG-I – jednego z czujników wrodzonej odporności, czyli pierwszej, szybkiej linii obrony organizmu przed infekcją. RIG-I rozpoznaje podejrzane cząsteczki RNA, w tym RNA związane z infekcją wirusową, i pomaga uruchomić produkcję interferonów typu I – sygnałów alarmowych, które ostrzegają komórkę i jej otoczenie przed zagrożeniem.

„Interesuje nas, w jaki sposób komórki odróżniają nieszkodliwe, własne RNA od RNA związanego z infekcją lub stresem. To pytanie jest kluczowe dla zrozumienia obrony przeciwwirusowej, ale także dla unikania szkodliwego stanu zapalnego, gdy ten sam system obronny zostaje aktywowany w niewłaściwym momencie” – mówi prof. Gracjan Michlewski.

Naukowcy wiedzieli już wcześniej, że RIG-I wykrywa RNA niosące na końcu 5′ grupę trifosforanową. Można ją potraktować jak chemiczny znacznik, który w wielu sytuacjach zwiększa „widoczność” RNA dla układu odpornościowego. Znacznie mniej jasne było natomiast to, czy znaczenie ma także pierwszy nukleotyd, czyli pierwsza „litera” cząsteczki RNA znajdująca się bezpośrednio przy tym końcu.

Zespół porównał więc bardzo podobne cząsteczki RNA, które różniły się właśnie tą pierwszą literą: A albo G. Nie chodziło o dużą zmianę sekwencji, lecz o subtelną różnicę na samym początku cząsteczki.

A i G: mała różnica, duży efekt

Wyniki wykazały, że dwuniciowe RNA rozpoczynające się od A silniej aktywuje szlak RIG- I/interferonów typu I niż porównywalne RNA rozpoczynające się od G. Innymi słowy, pojedyncza litera może wpływać na to, jak intensywnie komórka interpretuje RNA jako potencjalne zagrożenie.

Co ważne, różnicy tej nie dało się w pełni wyjaśnić samym wiązaniem RNA przez oczyszczone białko RIG-I w prostym układzie biochemicznym. To wskazało, że o odpowiedzi decyduje także środowisko żywej komórki, w tym białka, które gromadzą się wokół RNA.

Zespół wykazał, że RNA rozpoczynające się od G preferencyjnie rekrutuje białka wiążące GTP. GTP, czyli guanozynotrifosforan, to jedna z podstawowych cząsteczek wykorzystywanych w komórkach jako nośnik energii i przełącznik aktywności wielu białek. W tym badaniu kluczowe było to, że białka wiążące GTP mogą zbierać się przy RNA zaczynającym się od G i częściowo ograniczać jego rozpoznanie przez RIG-I.

To właśnie ten mechanizm łączy „zmianę litery” z odpowiedzią immunologiczną: pierwszy nukleotyd wpływa nie tylko na samą cząsteczkę RNA, ale także na zestaw białek, które do niej dołączają w komórce. Gdy na początku znajduje się G, RNA może zostać częściowo osłonięte przed komórkowym alarmem.

„Dla nas to bardzo satysfakcjonujący wynik, ponieważ pokazuje, że bardzo mała zmiana na początku cząsteczki RNA może wyraźnie wpływać na to, jak komórki rozpoznają zagrożenie. Szerzej rzecz ujmując, badanie dodaje brakujący element do naszej wiedzy o wczesnym alarmie przeciwwirusowym i o tym, dlaczego niektóre RNA wywołują silniejszą odpowiedź niż inne, dlaczego komórkowe RNA nie są rozpoznawane przez ten system, a także dlaczego niektóre wirusy mogą przez długi czas pozostać niewykryte przez nasz układ odpornościowy” – podkreśla prof. Michlewski.

Jak badacze to sprawdzili?

Aby zrozumieć mechanizm tego zjawiska, badacze połączyli kilka podejść eksperymentalnych: syntetyczne RNA, testy odpowiedzi immunologicznej w komórkach, sekwencjonowanie RNA, RNA pull-down połączony ze spektrometrią mas, testy biochemiczne wiązania białko-RNA, mikroskopię oraz pomiary wewnątrzkomórkowych nukleotydów.

RNA pull-down to metoda „wyławiania” wybranej cząsteczki RNA razem z białkami, które się z nią wiążą. Połączenie tej techniki ze spektrometrią mas pozwala sprawdzić, jakie białka rzeczywiście gromadzą się przy danym RNA w komórce.

Ważnym elementem pracy była też kontrola jakości RNA. Projekt badawczy zmienił kierunek po tym, jak zespół zauważył, że część wcześniejszych wyników mogła wynikać z niepożądanych produktów ubocznych powstających podczas syntezy RNA. W praktyce oznaczało to konieczność oddzielenia rzeczywistych efektów biologii i chemii RNA od efektów technicznych, czyli sygnałów powstających na skutek samego sposobu wytwarzania lub oczyszczania materiału.

Dla biotechnologii jest to ważna lekcja: czystość i kontrola jakości RNA mogą decydować zarówno o interpretacji wyników eksperymentów, jak i o właściwościach końcowych cząsteczek projektowanych do zastosowań badawczych lub terapeutycznych.

Znaczenie dla biologii i biotechnologii RNA

Autorzy podkreślają, że badanie nie opisuje gotowej terapii ani narzędzia diagnostycznego. Dotyczy podstawowego mechanizmu biologicznego. Takie mechanizmy często są jednak punktem wyjścia dla późniejszych zastosowań – zwłaszcza w obszarze technologii RNA, gdzie ważne jest przewidywanie, czy dana cząsteczka ma pobudzać odpowiedź immunologiczną, czy raczej jej unikać.

W szczepionkach i terapiach opartych na RNA odpowiedź immunologiczna może być pożądana, jeśli ma wzmocnić efekt działania, albo niepożądana, jeśli prowadzi do nadmiernego stanu zapalnego. Lepsze zrozumienie wpływu pierwszego nukleotydu może pomóc projektować RNA o bardziej przewidywalnych właściwościach.

„Nasze wyniki wpisują się w szerszy kierunek rozwoju biotechnologii RNA, pokazując prostą regułę, która może pomóc wyjaśniać immunogenność RNA i wspierać bezpieczniejsze, bardziej precyzyjne projektowanie cząsteczek terapeutycznych” – mówi prof. Michlewski.

Odkrycie może mieć także znaczenie ewolucyjne. Wiele wirusowych RNA oraz cząsteczek RNA wytwarzanych przez komórki różni się tym, od jakiego nukleotydu zaczyna się ich koniec 5′. „Nasze wyniki wskazują, że ta subtelna, jednoliterowa różnica na początku RNA mogła wpływać na to, jak RNA wirusowe i ludzkie ewoluowały przez miliony lat” – dodaje prof. Michlewski.

Współpraca międzynarodowa

Badanie prowadzone w Laboratorium Oddziaływań RNA-Białko – Centrum Dioscuri w IIMCB obejmowało współpracę zespołów z Polski, Niemiec i Wielkiej Brytanii. Połączyło kompetencje z zakresu biologii RNA, immunologii, proteomiki i zaawansowanych analiz molekularnych.

Finansowanie

Projekt sfinansowany w ramach programu Dioscuri, zainicjowanego przez Towarzystwo Maxa Plancka, wspólnie zarządzanego z Narodowym Centrum Nauki w Polsce oraz współfinansowanego przez polskie Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego oraz niemieckie Federalne Ministerstwo Badań, Technologii i Przestrzeni Kosmicznej [nr 2019/02/H/NZ1/00002 dla prof. G. Michlewskiego]. Pełna lista źródeł finansowania znajduje się w publikacji.

Fot. Obraz przedstawia dsRNA inicjujące A lub G. Dziurka od klucza symbolizuje RIG-I, natomiast białko związane z G-RNA reprezentuje białko wiążące GTP. Strzałki wskazują silne lub słabe aktywowanie sygnalizacji, co jest czerwonym dzwonkiem alarmowym. Źródło: IIMCB